アグロバクテリウムを利用した形質転換体作成用
5’primerにCACCを付加して3’校正機能のある酵素にてPCR
Takara Prime STAR HS使用の場合
反応例 for 50 ul for 20 ul
5x Prime STAR buffer (Mg2+ plus) 10 ul 4
dNTP 4 ul 1.6
Primer 10-15 pmol each 0.4(10u)
Template <200 ng 1
Prime STAR enzyme 0.5 ul 0.2
DW to 50 ul 12.4
1ml cultureからQiagen kit精製したplasmid (50 ul溶出）の場合1 ulテンプレートに用いる。
98℃ 10 sec
60℃ 10 sec
72℃ 1 min/kb x 28 cycle
72℃ 5 min
pENTR-D/TOPOにサブクローニング
TOPO vector : PCR product =1 : 2〜 2 : 1 （モル比）
Vector 1 ulに対し 1 kbなら1〜5 ng、2 kbなら5〜10 ng推奨。
PCR productは >20〜50 ng/ul を希釈して使用が望ましい。
（薄いのを濃縮してもうまくいかない事が多い。）
反応例
salt solution 0.5 ul
pENTR D-TOPO 0.5 ul
PCR product (MQWで希釈） 2 ul
RT 30 min （長ければよいというものではない。）
XL1-blue or TOP10 コンピテントセルをトランスフォーメーション
TOPO反応液全量を50-100 ulコンピテントセルと混合
on ice 15 min
42℃ 30 sec
on ice >2 min
+ SOC or LB or DW 150-300 ul
37℃ 1 h
LB/Kmプレートに全量を播く
37℃ o/n
コロニーをcPCR→culture→plasmid prep→(restriction→)sequence check
LR反応でdestination vector (binary vector)にクローニング
entry clone 50−150 ng 0.5 ul
destination vector 150 ng 0.5 ul
TE to 8 ul 3 ul
LR clonase II 4 ul 2 ul on iceで溶かしてVortex 2sec x2
25℃ (RT) o/n
+proteinase K 2 ul 1 ul
DH-5aコンピテントセルをトランスフォーメーション
反応は同上
LB/Sp プレートに全量を播く
コロニーをcPCR→culture→plasmid prep→restriction check
EHA101をトランスフォーメーション （月曜か火曜日に行う事を推奨）
2400 V / 0.2 cm
SOC rescue 30℃ 1h
LB/SP プレートに播く
30℃ 2 o/n culture
コロニーをPick upし LB/Sp 1 ml で30℃ 2 o/n culture
グリセロールストックを作成
