以下の試薬を調製。各試薬は実験の都度調製し、使い切る。
2 M Na2S2O5の調製
bisulfite (SIGMA) 570 mg
DW ( )ml
(total 1.5 ml)
注１；エッペンドルフチューブの目盛であわせる程度でよい。
注２；bisulfiteは水に溶けてNa2S2O5になる。粉末状態ではmetabisulfateであるため分子量計算に注意が必要。
注３；激しく攪拌してはいけない。
3 M NaOHの調製
NaOH 0.2 g （およそ一粒）
DW 1.66 ml （NaOHの体積は無視）
100 mM hydroquinone
hydroquinone 11 mg
DW 1 ml
手順
genome DNAの断片化
genome DNA 20 µl (40µg)
DW 80 µl
(total 100 µl)
Sonication 10 sec (TOMY UR-P20だったっけ？ full power, on ice)→genome flag.
NaOHで変性
genome flag. 10 µl
DW 35 µl
3 M NaOH 5 µl
37℃ 30 min
注；長くても短くても良くない。heat blockもしくはPCR機を利用して確実に加熱。
bisulfite添加 上記mixtureに以下を添加。
2 M Na2S2O5 350 µl
100 mM hydroquinone 2 µl
55℃ 18 hrs
注；多少の長短はOK。16〜20 hrs位。heat blockもしくはPCR機を利用して確実に加熱。
結露防止機構付きPCR機以外を使用時はミネラルオイルをエッペン内に滴下し、蒸発を防ぐ。
脱塩回収
上記mixtureをDWで２倍以上に希釈。Glassmilkの説明書に従って回収。
注；bisulfite mixtureは非常に高塩濃度であり、ある程度希釈した方が以下の回収率が良かった。
以下は具体例
上記mixture 50 µl
DW 75 µl
NaI Soln. 375 µl
↓ mix well
+Glassmilk 5 or 10 µl
↓ mix well
↓ room temp. 5 min
(時々mix。ずっと緩いmixerにかけておくのも可）
↓ フィルターユニットに全量移動
↓ spin in 5000 rpm for 1min at room temp. sup.は不要（下のエッペン内）
+NEW WASH 500 µl
↓ spin in 5000 rpm for 1min at room temp. sup.は不要（下のエッペン内）
+NEW WASH 500 µl (repeat)
↓ spin in 5000 rpm for 1min at room temp. sup.は不要（下のエッペン内）
↓ 乾燥。（ピーズが白くなるまで）
↓ 下のエッペンを新品に換え、フィルターにDWを45 µl添加しsuspend
↓ spin in 5000 rpm for 1min at room temp. sup.を回収する。（下のエッペン内）
NaOHで再変性
上記回収溶液 45 µl
3 M NaOH 5 µl
37℃ 15 min
注；長くても短くても良くない。heat blockもしくはPCR機を利用して確実に加熱。
中和、回収
上記mixture 50 µl
4 M NH4OAc 150 µl
EtOH 500 µl
↓ spin in 15000 rpm for 15 min at 4℃
ppt. を25 µl DWに溶解し最終サンプルとする。
PCRを行うfor 4 samples(4 eppendorf tubes)
2.5 mM dNTP 8 µl
10 X Fast Start Taq buffer 10 µl
GC-rich buffer for FST 20 µl
template 5 µl(100〜200 ng)
Fast Start Taq 0.5 µl
primer F 10 µl
primer R 10 µl
DW 33.5 µl
(total 100 µl)
PCR条件 PCR機はEppendorf Mastercycler Gradientを使用
1 94℃ 4 min
2 94℃ 1 min
3 62℃ 1 min
4 72℃ 1 min
5 return to step2 / repeat 14times
6 94℃ 1 min
7 62℃ 1 min
8 72℃ 1 min & time delay +5 sec
9 return to step6 / repeat 14times
10 72℃ 7 min
備考；２〜４の繰り返し３０回でも問題ないかもしれない
PCR産物を回収
アガロースゲルにて電気泳動〜切り出し回収（GENECLEAN II使用）
PCRと同じプライマーでシークエンス読む。
