enzyme solution total 20 ml
1%(w/v) Cellulase "onozuka" RS 0.2 g
0.1%(w/v) Macerozyme R10 0.02 g
0.6 M mannitol 1 M 12 ml
10 mM MES (pH5.7) 0.5 M 0.4 ml
1 mM CaCl2 1 M 20 ul
1 mM MgCl2 1 M 20 ul
10 mM b-mercaptoethanol 14 ul
0.1%(w/v) BSA 10% 0.2 mlwash solution total 100 ml
0.6 M mannitol 1 M 60 ml
10 mM MES (pH5.7)) 0.5 M 2 ml
20 mM KCl 1 M 2 ml
2nd leavesの中央４cmくらいの部分を0.5〜1mmにきざむ
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enzyme solutionに浸して脱気30 min（スターラーで緩く撹拌しながら）
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３hr 25℃ 40 rpm
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ロータリーシェーカーで80 rpm 10 min揺する
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70 umメッシュで濾す
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濾液を100xG 2 minで遠心 (kubota 1100rpm)
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pptをwash solution（氷冷）に撹拌
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濾液を100xG 2 minで遠心
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pptをwash solution（氷冷）に撹拌
